Bài giảng thực hành sinh lí động thực vật - Nguyễn Hoài Hương

00 BC/mm3 a) Vật liệu cần thiết Tương tự như phần đếm hồng cầu - Buồng đếm Neubauer để đếm bạch cầu là 4 ô vuông lớn ở 4 góc có diện tích mỗi ô lớn là 1 mm2. Mỗi ô vuông lớn được chia thành 16 ô vuông nhỏ - Ống trộn bạch cầu: trong bầu phình có viên đá hoặc nhựa màu trắng, trên ống có khắc vạch 0,5 – 1 – 11. - Dung dịch pha loãng bạch cầu: là dung dịch có tác dụng phá vỡ hồng cầu, đó là dung dịch HCl 1N hoặc acid acetic 2 – 3%. b) Cách làm - Lấy máu: tương tự - Pha loãng: hút máu đến vạch 0,5 rồi hút dung dịch pha loãng đến 11, như vậy bạch cầu được pha loãng 20 lần - Trộn máu - ChuNn bị buồng đếm - Cho máu vào buồng đếm - Đếm máu: Trên buồng đếm Neubauer đếm 4 ô vuông ở 4 góc với tổng số 64 trung bình. Cách đếm giống như đếm hồng cầu. c) Cách tính toán Nếu gọi B là số bạch cầu đếm được trên 64 ô trung bình (4 mm2) thì số bạch cầu trong 1 mm3 sẽ là: B x 10 x 20 Số bạch cầu trong 1 mm3 = --------------------- = B x 50 4 Trong đó: B: số bạch cầu đếm được 1/10: chiều cao từ buồng đếm đến lamelle 20: độ pha loãng 4: vì 1 mm3 có 16 ô trung bình trong khi đó đếm 64 ô 28 d) Rửa dụng cụ - Sau khi làm xong phải thổi hết dung dịch máu trong ống trộn hồng cầu và rửa nhiều lần bằng HCl 0,1N, nước cất. - Rửa buồng đếm bằng nước cất và lau nhẹ bằng bông gòn - Sấy hoặc lau khô buồng đếm, ống trộn. III. BÀI NỘP 1. Mô tả thí nghiệm và kết quả. 2. Ý nghĩa của kết quả phân tích số lượng hồng cầu và bạch cầu: cao hơn hoặc thấp hơn giá trị trung bình. 3. Nêu ứng dụng phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu đối với các đối tượng tế bào khác. 29 BÀI 4 KHẢO SÁT ENZYME CATALASE TRONG GAN I. LÝ THUYẾT Gan là một cơ quan trung gian giữa tiêu hóa và trao đổi chất của cơ thể. Gan có các chức năng chính sau đây: - Chức năng trao đổi chất bao gồm cả dị hóa và đồng hóa: chuyển hóa protein, chuyển hóa carbohydrate, chuyển hóa lipid, chuyển hóa cholesterol. - Chức năng dự trữ: vitamin tan trong dầu, B12, Fe, dự trữ máu. - Chức năng tiết mật để tiêu hóa chất béo - Chức năng khử độc: NH3, sắc tố độc porphyrin, purine, thuốc, các chất độc từ môi trường như kim loại nặng, thuốc trừ sâu, alcohol... Hình 1: Cấu tạo gan Quá trình trao đổi chất xảy ra mạnh mẽ ở tế bào gan dẫn đến số lượng peroxisome trong tế bào gan rất cao. H2O2, một dạng gốc tự do (reactive oxygen species, ROS) sinh ra trong quá trình trao đổi chất bình thường hay bệnh lý là phụ phNm độc của quá trình trao đổi chất của tế bào được phân hủy nhờ catalase – enzyme chủ yếu của peroxisome. Catalase là enzyme thuộc nhóm oxy hóa khử (oxidoreductase, EC 1.11.1.6). Đó là một hemoprotein, một phân tử catalase chứa 4 nguyên tử sắt. Catalase xúc 30 tác phản ứng phân hủy hydrogen peroxide (H2O2) thành nước và oxy theo phương trình sau: 2H2O2 → 2H2O + O2 Catalase có trong mọi tế bào, đặc biệt trong gan và hồng cầu. Đây là một enzyme thuộc chức năng giải độc của gan hoạt động mạnh nhất. Ngoài việc phá hủy hydrogen peroxide, catalase còn oxy hóa các rượu phân tử như methanol, ethanol. II.THỰC HÀNH 1. Nguyên tắc: Trong bài này sinh viên sẽ tách chiết catalase từ gan bò bằng hỗn hợp dung môi alcohol: chloroform 1:1 và kết tủa enzyme bằng ammonium sulfate. Cuối cùng hoạt tính catalase được xác định qua nồng độ cơ chất được sử dụng trong phản ứng enzyme. Muốn vậy, nồng độ H2O2 còn lại sau phản ứng được xác định tại thời điểm “0” và thời điểm “t” của phản ứng bằng phương pháp chuNn độ iod rồi lấy hiệu số. Để chuNn độ Iod, ta thêm KI vào hỗn hợp phản ứng. Trong điều kiện acid, KI chuyển thành HI. H2O2 oxy hóa HI thành Iod tự do theo phương trình: H+ + KI → HI + K+ H2O2 + 2HI → I2 + H2O Một mol H2O2 giải phóng 1 mol I2. Iod tự do được chuNn độ bằng sodium thiosulfate với sự có mặt của dung dịch tinh bột làm chất chỉ thị màu. Khử I 2 thành 2I- lạ i làm dung d ịch mấ t màu theo phương t r ình : 2Na2S2O3 + I2 →2NaI+Na2S4O6 Phương trình tổng quát: H2O2 + 2HI + 2Na2S2O3 → 2NaI+Na2S4O6+ H2O Qua lượng dung dịch sodium thiosulfate sử dụng để chuNn độ, ta tính lượng H2O2 còn lại tại mỗi thời điểm phản ứng enzyme. 2. Vật liệu
Gan bò tươi (có thể trữ động lạnh vài ngày) 5 g cho mỗi nhóm
Cân
Cối, chày 31
Bình tam giác 100 ml: 3 cái
Cốc thủy tinh có mỏ 50 ml: 1 cái
Máy ly tâm
Ống ly tâm 50 ml
Đũa thủy tinh
Biuret chuNn độ
Pipette Hóa chất:
Hỗn hợp dung môi ethanol: chloroform = 1:1
Dung dịch đệm phosphate 0,15 M pH = 7,2
(NH4)2SO4
H2SO4 1M
Dung dịch H2O2 10mM trong đệm phosphate 0,15 M, pH = 7,2.
Dung dịch KI 5%
Dung dịch ammonium molybdate bão hòa
Dung dịch 0,005 M Na2S2O3
Dung dịch tinh bột 0,1%. 3. Quy trình thí nghiệm a) Tách chiết catalase từ gan bò: - Cắt 5 g gan bò thành miếng nhỏ, thêm 10 ml nước cất rồi nghiền trong cối. - Chuyển gan đã nghiền sang bình tam giác, thêm 5 ml hỗn hợp ethanol-chloroform (1:1) và lắc mạnh trong vòng một phút. - Ly tâm dịch nghiền gan 3000 vòng/min trong 10 phút. - Lấy dịch trong chứa catalase, đo chính xác thể tích V. Thêm vào dung dịch catalase mới thu được ammonium sulphate (3 g cho mỗi 10 ml dung dịch enzyme). Dùng đũa thủy tinh khuấy cho đến khi hòa tan toàn bộ muối. - Catalase kết tủa sẽ được tách bằng ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ dịch trong. - Thêm vào ống ly tâm một thể tích đệm phosphate 0,15 M (pH=7,2) bằng thể tích dịch trong vừa loại bỏ để hòa tan kết tủa. Đó là dung dịch catalase gốc. - Pha loãng dung dịch enzyme gốc 100, 200, 400 lần và xác định hoạt tính. b) Xác định hoạt tính catalase. 32 ChuNn bị 2 bình tam giác 100 ml và đánh dấu 1 bình là đối chứng (ĐC) và 1 bình là thí nghiệm (TN). - Cho vào mỗi bình tam giác 5 ml H2 O 2 10 mM pha trong đệm phosphate. - Cho vào bình đối chứng 5 ml H2SO4 1M. - Thêm vào mỗi bình tam giác 1 ml dung dịch catalase pha loãng. (Enzyme trong bình đối chứng b ị bấ t hoạt ngay từ đầu do acid). - Sau 5 phút, thêm vào bình thí nghiệm 5 ml H2SO4 1M. để chấm dứt phản ứng enzyme. - Thêm vào bình tam giác 1ml KI 5% và 0,5 ml dung dịch ammonium molybdate bão hòa, lắc và để yên 3 phút. - ChuNn độ I2 sinh ra bằng sodium thiosulfate 0,005M đến khi thấy màu vàng nhạt. Cho vào 3 giọt dung dịch tinh bột 0,1 % thấy màu xanh xuất hiện. - Tiếp tục chuNn độ vớ i sodium thiosulfate 0,005M cho đến khi mấ t màu hoàn toàn . Bảng tóm tắt phương pháp xác định hoạt tính enzyme catalase Hóa chất Đối chứng Thí nghiệm Phản ứng enzyme H2O2 10 mM trong đệm phosphate pH = 7,2 5 ml 5 ml H2SO4 1M 5 ml - Dung dịch enzyme pha loãng 1 ml 1 ml Phản ứng enzyme 5 phút, nhiệt độ phòng H2SO4 1M - 5 ml Xác định H2O2 còn lại trong hỗn hợp phản ứng enzyme KI 5% 1 ml 1ml Ammonium molybdate bão hòa 3 giọt 3 giọt ChuNn độ bằng Na2S2O3 0,005 M Màu vàng nhạt Màu vàng nhạt Tinh bột 0,1% 3 giọt 3 giọt 33 ChuNn độ tiếp bằng Na2S2O3 0,005 M Mất màu xanh của phản ứng iod – tinh bột Mất màu xanh của phản ứng iod – tinh bột Thể tích Na2S2O3 0,005 M dùng để chuNn độ VĐC = VTN = c) Tính kết quả Hoạt tính enzyme đo bằng đơn vị katal (1 mol cơ chất bị phá hủy trong 1 giây) hoặc đơn vị quốc tế U (1 micromol cơ chất bị phá hủy trong 1 phút). Thí dụ tính toán hoạt tính catalase: Thể tích Na2S2O3 0,005 M dùng để chuNn độ mẫu đối chứng và thí nghiệm là VĐC = 16,3 ml và VTN = 12,1 ml. Như vậy, trong thời gian phản ứng 5 phút lượng H2O2 bị phân hủy tương ứng (VĐC –VTN) =16,3 – 12,1 = 4,2 ml dung dịch sodium thiosulfate 0,005 M. Biết rằng 1 ml sodium thiosulfate 0,005M dùng để chuNn độ tương ứng 2,5 µmol H2O2, như vậy, số micromole cơ chất bị phân hủy được tính như sau: 1,0 ml Na2S2O3 0,005M - 2,5 micromol H2O2 4,2 ml Na2S2O3 0,005M - X micromol H2O2 X = 10,5 micromol H2O2 Để biểu diễn hoạt tính enzyme bằng đơn vị quốc tế, chia số lượng micromole H2O2 bị phân hủy cho số phút thời gian phản ứng. Trong trường hợp trên hoạt tính enzyme catalase trong dung dịch enzyme pha lõang là )( phútt X = 10,5 micromole: 5 = 2,1 U/ml. Để biểu diễn hoạt tính enzyme bằng katal, chuyển micromole thành mol và phút thành giây. Hoạt tính dung dịch enzyme gốc = hoạt tính enzyme thí nghiệm x hệ số pha loãng n = )( phútt nX • Để hoạt tính enzyme catalase trong 1g gan bò, cần tính đến thể tích dung dịch chiết enzyme và khối lượng gan bò dùng để tách chiết enzyme (5g). Tóm lại, hoạt tính catalase/ 1 g gan bò A (U) = mphútt VnX • •• )( 34 X số micromol H2O2 n = hệ số pha loãng (ví dụ n = 200) V = thể tích dung dịch chiết enzyme (ml) t = thời gian phản ứng (phút) m= khối lượng gan bò (g) A (U) = 55 102005,10 • •• A = 840 U/g A (katal) = )( 10)( -6 giâyt UA • = 60 10840 -6• = •14 -610 katal/g = •14 10-6 katal/(10-3 kg) = •14 10-3 katal/ kg. III.BÀI NỘP 1. Mô tả thí nghiệm và cách tính toán cùng với kết quả hoạt tính theo bảng sau: Đơn vị quốc tế U Katal Hoạt tính catalase trong mẫu thí nghiệm (đvht/ml) Hoạt tính catalase trong dung dịch enzyme gốc (đvht/ml) Hoạt tính catalase trong 1 g gan bò (đvht/g) 2. So sánh họat tính enzyme với các hệ số pha lõang khác nhau. 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Evert RF. Essau’s Plant Anatomy. Third Edition. Wiley Interscience. 2006 2. Nguyễn Bá. Hình thái học thực vật. Nhà xuất bản giáo dục.2006. 3. Hematology Laboratory: Manual RED Cell Counts CLS 312. The clinical laboratory sciences of the University Mississipi Medical Center. cls.umc.edu/COURSES/CLS312/rbcounts.doc. 4. Dunn EE, Morgulis S. Studies on the catalase and peroxidase activity of the liver cell. J. Biol. Chem. 1937. 5. Tauber H, Petit ED. Convenient Methods for preparing crystalline catalase from cow liver. J. Biol. Chem. 1951. 36 PHỤ LỤC Vật liệu thí nghiệm Lá khoai lang Lá lốt Thân cây hoa hồng Rau tần dày lá (húng chanh) Cây chanh (Citrus limon) Cây cỏ voi Cây rau muống Cây dâm bụt