Giáo án Sinh học phân tử - Chương trình cả năm

ác động vật hoang dã, người và các loài côn trùng khác. Gen độc tố được phân lập từ vi khuẩn, liên kết với promoter hoạt động sau đó được chuyển vào trong ngô, cà chua, khoai tây và bông. Gen này đã sản xuất độc tố đối với côn trùng trong cây, và sâu bướm khi ăn cây đã bị chết. Công nghệ DNA tái tổ hợp cũng đã cho phép phát triển tính kháng chất diệt cỏ ở thực vật. Một vấn đề quan trọng trong nông nghiệp là điều khiển các cỏ dại cạnh tranh nước, ánh sáng và chất dinh dưỡng với cây trồng. Mặc dù chất diệt cỏ có tác dụng giết cỏ dại, nhưng chúng cũng có thể gây nguy hiểm cho cây trồng. Các gen cung cấp tính kháng cho nhiều loại chất cỏ dại đã được chuyển vào cà chua, đậu tương, bông, cây cải dầu và các cây trồng thương mại quan trọng khác. Khi đồng ruộng có canh tác các cây trồng này được phun thuốc diệt cỏ, thì cỏ dại bị giết nhưng các cây trồng biến đổi di truyền lại không bị ảnh hưởng. Năm 1999, đã có hơn 21 triệu ha cây đậu tương biến đổi di truyền và 11 triệu ha cây ngô chuyển gen được trồng trên thế giới. Công nghệ DNA tái tổ hợp cũng được ứng dụng cho các vật nuôi. Ví dụ: gen sản xuất hormone sinh trưởng được phân lập từ gia súc và được tạo dòng trong E. coli, các vi khuẩn này sản xuất một lượng lớn hormone sinh trưởng của bò, yếu tố liên quan đến tăng sản xuất sữa. Các động vật chuyển gen được phát triển để mang gen mã hóa cho các sản phẩm dược liệu. Ví dụ: một gen người mã hóa cho nhân tố VIII (hình thành tơ huyết) được liên kết với vùng điều hòa của gen sản xuất β-lactoglobulin ở cừu, một protein tạo sữa. Gen dung hợp được tiêm vào phôi cừu, tạo ra một con cừu chuyển gen có khả năng sản xuất trong sữa của nó nhân tố đông máu của người. Một phương thức tương tự được dùng để chuyển gen α1-antitrysin, một protein dùng để điều trị bệnh nhân khí thũng di truyền (hereditary emphysema), vào trong cừu. Cừu cái mang gen này sản xuất rất nhiều α 1-antitrysin khoảng 15g trong 1 lít sữa của chúng. 4. Thuốc oligonucleotide Một ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong thời gian gần đây đó là phát triển các thuốc oligonucleotide có trình tự phân tử DNA hoặc RNA nhân tạo ngắn có thể được dùng để điều trị bệnh. Các antisense oligonucleotide bổ sung cho các RNA không mong muốn, như là RNA của virus. Khi được bổ sung vào tế bào, thì các antisense DNA này liên kết với mRNA của virus và ức chế sự dịch mã của chúng. Các DNA oligonucleotide sợi đơn liên kết chặt chẽ với các trình tự DNA khác, tạo thành một phân tử triplex DNA. Sự tạo thành triplex DNA cản trở liên kết của RNA polymerase và các protein khác cần cho sự phiên mã. Các oligonucleotide khác là các ribozyme, các phân tử RNA mà chức năng như là các enzyme. Những phức hợp này liên kết với các phân tử mRNA đặc hiệu và cắt chúng thành từng đoạn, phá hủy khả năng mã hóa protein của chúng. Một số thuốc oligonucleotide đã sẵn sàng để thử nghiệm trong điều trị bệnh AIDS và ung thư. 5. Liệu pháp gen Đối với loại bệnh di truyền, bệnh do đột biến gen người ta phải cần đến sự can thiệp của liệu pháp gen, một hướng chữa bệnh gắn liền với các kỹ thuật tiên tiến trong lĩnh vực công nghệ sinh học hiện đại như các vi thao tác gen, sửa đổi thay thế gen... Liệu pháp gen (gene therapy) thực chất là phương pháp chữa bệnh bằng gen. Có nhiều khái niệm khác nhau về liệu pháp gen, nhưng cách hiểu chung nhất là tập hợp các biện pháp để sử dụng các gen cần thiết (còn gọi là gen trị liệu) nhằm mục đích chữa bệnh cho con người. Trong đó, gen trị liệu có thể là: - Các gen hoạt động bình thường (gen lành) có thể đưa vào tế bào để thay thế gen hỏng, gen mất chức năng, khôi phục hoạt động bình thường của tế bào và sự sống của cơ thể. - Là những gen có khả năng mã hóa một protein đặc hiệu, khi đưa vào tế bào sống có thể tạo nên các loại protein đặc hiệu. Các loại protein đặc hiệu có thể ức chế hoạt động của một gen khác trong tế bào, kìm hãm khả năng phân chia của tế bào hoặc gây chết các tế bào bị bệnh. - Những gen khi đưa vào tế bào hoạt động đồng thời với các gen bệnh (gen bị đột biến trong tế bào) làm hạn chế tác động của gen bệnh hoặc hỗ trợ, bù đắp cho các gen bị hỏng. - Gen trị liệu còn là các gen bất hoạt được đưa vào tế bào thay thế cho một gen lành nào đó, nhằm hạn chế sản phẩm không cần thiết của gen lành hoặc tạo ra cho tế bào một trạng thái mới, có tác dụng chống lại bệnh tật. - Gen trị liệu có thể là những đoạn oligonucleotide có tác dụng kìm hãm hoạt động của gen bị hỏng, bị đột biến trong tế bào. 6. Chẩn đoán bệnh để can thiệp sớm Bằng kỹ thuật chọc ối, kết hợp đồng thời phân tích máu bố mẹ bằng enzyme hạn chế, người ta có thể chẩn đoán sớm trước khi sinh (vì enzyme hạn chế có khả năng phân biệt được gen đột biến với gen bình thường). Các đoạn DNA cắt ra, được phân tách qua phương pháp điện di, đem lai với các mẫu dò DNA hoặc RNA đã đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32P hoặc huỳnh quang. Ảnh phóng xạ tự ghi hoặc tín hiệu huỳnh quang cho ta thấy các đoạn DNA được lai với các mẫu dò. Các đoạn này được tách ra để nghiên cứu và xác định đột biến hay bình thường bằng enzyme hạn chế, vì một số đột biến di truyền có ảnh hưởng đến các vị trí dành cho enzyme hạn chế. Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong lĩnh vực này có nhiều thuận lợi hơn các phương pháp kinh điển. Thứ nhất, có thể rút ngắn được thời gian nhờ ứng dụng kỹ thuật PCR, chẳng hạn chẩn đoán bệnh HIV-1, dùng phương pháp PCR chỉ mất một ngày so với 3-4 tuần nuôi cấy của phương pháp truyền thống. Thứ hai, đối với các tác nhân gây bệnh khó nuôi cấy hay không thể nuôi cấy thì kỹ thuật sinh học phân tử là giải pháp duy nhất, chẳng hạn Chlamydia, Brucella, viêm gan B,... Thứ ba, việc tạo dòng một gen dùng làm probe đơn giản hơn việc sản xuất kháng thể đặc hiệu, hơn nữa với một probe người ta có thể phát hiện tất cả các kiểu huyết thanh (serotype) của tác nhân gây bệnh, điều mà chỉ một kháng thể không thể làm được. Cuối cùng, nếu trước kia phải cần đến nhiều kỹ thuật (quan sát dưới kính hiển vi, nuôi cấy trên một loạt môi trường, miễn dịch học...) thì hướng chẩn đoán bằng sinh học phân tử chỉ cần một kỹ thuật (lai phân tử hoặc PCR). Đối với tác nhân là virus, các kỹ thuật lai phân tử và PCR đã cho phép chẩn đoán nhiều nhóm như papillomavirus, HBV, HIV. Đặc biệt phương pháp lai tại chỗ còn cho phép xác định trực tiếp virus trên lát cắt sinh thiết. Đối với các tác nhân vi khuẩn, đã có nhiều bộ kit chẩn đoán sinh học phân tử được thương mại hóa như: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium pneumoniae, Salmonella, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae... Đối với các tác nhân ký sinh trùng, người ta cũng đã thành công trong chẩn đoán Plasmodium, Schistosoma, Trypanosoma, Toxoplasma, Leishmania bằng lai phân tử. Phương pháp PCR còn cho phép phát hiện tác nhân ngay trong vật trung gian truyền bệnh. 7. DNA fingerprinting Sử dụng các trình tự DNA để nhận dạng một người, được gọi là DNA fingerprinting, là một công cụ rất mạnh để khảo sát tội phạm và các ứng dụng pháp lý khác. Trong một ứng dụng đặc trưng, DNA fingerprinting có thể được dùng để xác nhận một sự nghi ngờ hiện diện ở hiện trường gây án. Một mẫu DNA của máu, tóc, tinh dịch hoặc mô của cơ thể được thu thập từ hiện trường. Nếu mẫu là rất nhỏ, phương pháp PCR có thể được dùng để khuếch đại cho đủ DNA, sẵn sàng cho việc kiểm tra. Các mẫu DNA bổ sung được thu thập từ một hoặc nhiều nghi can khác. Mỗi một mẫu được cắt với một hoặc nhiều RE, và kết quả các đoạn DNA được phân tách bằng điện di. Các đoạn trên gel được biến tính và chuyển lên màng nitrocellulose bằng thẩm tích Southern (blot). Một hoặc nhiều probe (được đánh dấu phóng xạ) sau đó được lai với màng nitrocellulose và được phát hiện bằng phóng xạ tự ghi. Kiểu của băng được tạo ra bởi DNA từ mẫu được thu thập ở hiện trường sau đó được so sánh với các kiểu được tạo ra bởi DNA từ những nghi can. Các probe được dùng trong DNA fingerprinting phát hiện các vùng thay đổi cao của genome, vì thế cơ hội DNA từ hai người sản xuất chính xác cùng một kiểu băng là rất thấp. Khi một số probe được dùng trong phân tích, thì xác suất mà hai người có cùng một tập hợp các kiểu là gần như không có (trừ khi họ là cặp sinh đôi giống hệt nhau). Mẫu khớp nhau từ hiện trường và nghi can có thể cung cấp bằng chúng rằng nghi can có mặt tại hiện trường vụ án. Probe được dùng phổ biến nhất trong DNA fingerprinting bổ sung cho các trình tự lặp lại ngắn được tìm thấy rất nhiều trong genome người. Con người khác nhau rất nhiều về số lượng bản sao của các trình tự lặp lại này; vì vậy, các đa hình này được gọi là số lượng biến thiên của các đoạn lặp lại tuần tự (VNTRs). DNA fingerprinting cũng được sử dụng để cung cấp thông tin về mối quan hệ huyết thống và các nguồn cơ thể sống khác. Ví dụ: DNA fingerprinting được dùng để xác định một số mẫu vi khuẩn gây bệnh than (anthrax) gửi bằng bưu điện đến những người khác trong năm 2001 tất cả là từ một nguồn mẫu. 8. Lập bản đồ gen Một đóng góp có ý nghĩa của công nghệ DNA tái tổ hợp đó là cung cấp một lượng lớn các marker (chỉ thị) di truyền được dùng trong lập bản đồ gen. Một nhóm trong số các marker được dùng trong lập bản đồ gen đó là restriction fragment length polymorphism (RFLP). RFLP là những biến đổi đa hình trong các kiểu của các đoạn DNA được tạo ra khi phân tử DNA được cắt cùng một enzyme hạn chế. Nếu DNA từ hai người được cắt bởi cùng một enzyme và kiểu của các đoạn DNA khác nhau được tạo ra, thì hai người này phải có sự khác nhau về các trình tự DNA của họ. Những sự khác nhau này được di truyền và có thể được dùng trong lập bản đồ, tương tự với phương thức mà trong đó sự khác nhau về allele được dùng để lập bản đồ các gen thông thường. Theo truyền thống, bản đồ gen được dựa vào việc sử dụng các sai khác di truyền tạo ra những sai khác kiểu hình có thể quan sát dễ dàng. Đáng tiếc là do hầu hết các tính trạng bị ảnh hưởng bởi đa gen và môi trường, nên số lượng các tính trạng có cơ sở di truyền đơn giản thích hợp cho việc sử dụng bản đồ bị giới hạn. RFLP cung cấp một số lượng lớn các marker di truyền có thể được dùng để lập bản đồ gen của sinh vật.