Báo cáo Thực tập kỹ thuật mới trong công nghệ Sinh học - Bùi Phương Thuận

BÁO CÁO THỰC TẬP KỸ THUẬT MỚI TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS. Bùi Phương Thuận ThS: Nguyễn Thị Hồng Loan Sinh viên: Trần Tuấn Anh Nội dung thực tập Thực hiện thao tác trực tiếp từng bước phương pháp Sắc ký trao đổi ion để tách, tinh sạch protein Mục đích nhằm tách protein Bromelain tinh sạch trên cây Dứa. Enzyme Bromelain là một hỗn hợp được chiết từ quả dứa và qua nhiều nghiên cứu, giới khoahọc đã phát hiện ra đây là loại enzyme tiêu hoá có chứa nhiều protein tiềm ẩn (thường được gọi là cysteine proteinases). Loại enzyme này có tác dụng tăng cường sức khoẻ cho hệ tiêu hoá, chống viêm nhiễm, tắc nghẽn thành mạch máu, giảm thiểu phát triển các khối u trong cơ thể. Cơ sở lý thuyết Sắc ký Khái niệm Sắc ký là tên gọi chung của phương pháp tách các chất. Năm 1903, Svet nhà khao học người Nga lần đầu tiên dụng cột sắc ký hấp phụ (than hoạt tính) để tách các sắc tố thực vật từ hỗn hợp dịch chiết thành các lớp có màu khác nhau. Do vậy mà nó được đặt tên là phương pháp Sắc ký – Chromatography (hay ghi màu). Tên gọi này được giữ tới bây giờ dù có nhiều chất phân tách không phải chất màu. Nguyên tắc Dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha : pha cố định và pha di động. Phân loại Dựa trên hiện tượng hóa lý trong quá trình tiến hành chia thành 3 nhóm: Sắc ký hấp phụ Sắc ký phân bố Sắc ký trao đổi ion Dựa trên hình dạng chất giá chia thành: Sắc ký trên cột Sắc ký trên giấy Sắc ký lớp mỏng Sắc ký khí Sắc ký trao đổi ion - IEC Giới thiệu chung Tương tác ion – cơ sở của việc tách và tinh chế protein bằng IEC đã được ứng dụng thành công từ cuối những năm 1940. IEC hiện tại là kỹ thuật tách protein phổ biến nhất, được sử dụng nhiều nhất trong các quy trình tinh chế và tinh sạch protein. IEC: 75% Sắc ký ái lực – AC: 60% Sắc ký lọc gel – GF: 50% Nguyên tắc Trước tiên protein sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tương tác ion giữa các nhóm mang điện tích trái dấu. Sau đó protein được chiết rút riêng biệt nhờ việc tăng dần lực ion làm cho tương tác ion bị bẻ gãy thông thường dùng gradient muối NaCl hay gradient pH. Cơ sở của IEC là sự cạnh tranh các nhóm tích điện trái dấu trên chất trao đổi giữa các ion của chất cần tách với các ion khác. Tương tác giữa các phân tử nhỏ và chất trao đổi phụ thuộc vào điện tích phân tử và lực ion môi trường. Khi nồng độ ion cạnh tranh thấp các ion cần tách sẽ lien kết với chất trao đổi ion. Khi nồng độ ion cạnh tranh cao các ion cần tách sẽ rời ra. Tương tác giữa protein và chất trao đổi còn phụ thuộc vào: Sự phân bố điện tích bề mặt của protein pH dịch đệm Bản chất các ion trong dung dịch Các chất thêm vào Đặc tính của chất trao đổi Giá thể Giá thể có chứa các nhóm tích điện có thể là tích điện âm hoặc tích điện dương. Nếu tích điện dương gọi là “trao đổi anion”, còn tích điện âm gọi là “trao đổi cation”. Một số giá thể thông dụng như: Sephadex, DEAE-Cellulose, Agarose Dụng cụ, hóa chất Cốc thủy tinh, bình tam giác, lọ đựng hóa chất, ống nghiệm nhỏ Cột sắc ký, giấy lọc Một số máy móc: máy xay sinh tố, máy ly tâm, máy đo OD Đệm chạy sắc ký Tris-HCl 50mM, pH 0.8, NaCl 50mM (đệm A). Phương pháp tiến hành Chuẩn bị mẫu Cân 50g chồi dứa, dùng dao thái nhỏ và nghiền trong 50ml đệm A bằng máy xay sinh tố. Sau khi chồi dứa được nghiền thành dạng đồng nhất tiến hành li tâm 10000 vòng/15 phút/4°C, tiếp đến thu lấy dịch trong rồi lọc bằng giấy lọc để thu dịch trong. Chuẩn bị gel (đã pha sẵn) Giá thể sử dụng là DEAE-cellulose Tiến hành cân DEAE-cellulose ở dạng bột khô một lượng vừa đủ để tạo ra 10ml gel rồi ngâm để trương nở trong đệm A. Nhồi cột gel Rửa và tráng sạch cột rồi dựng cột thẳng đứng trên giá. Tráng qua cột bằng đệm A rồi đóng khóa phía dưới cột Khuấy nhẹ hòa đều gel rrooif dùng pipet bơm từ từ vào cột (cần chú ý tránh tạo bọt trong gel và gel phân lớp không đồng nhất), để gel lắng một lúc. Mở khóa để đệm chảy ra và để gel lắng dưới tác dụng của áp suất trong cột. Tiếp tục đổ gel vào cột cho đến khi gel trong cột được khoảng 10ml. Cân bằng gel Sau khi nhồi xong cột gel phải được cân bằng bằng đệm A. Dùng pipet bơm từ từ đệm A lên cột gel cho đẹm chảy qua cột với tốc độ khoảng 30-60 ml/h. Gắn mẫu lên cột Cho lớp dịch đệm chảy đến sát mặt gel Dùng pipet hút mẫu cần tách cho từ từ vào cột Rửa mẫu Nhằm loại sạch những còn dính lại trong cột nhưng không gắn với giá thể, loại bỏ những protein gắn yếu Cho đệm A chảy qua từ từ tốc độ khoảng 25ml/h trong khoảng 3h đến khi OD280 của dịch rửa khoảng 0.1 thì không phải rửa nữa. Chiết mẫu Rửa chiết mẫu bằng gradient NaCl từ 50mMà1M với thể tích 80ml. Sử dụng thiết bị tạo gradient gồm 2 lỗ: một lỗ chứa 40ml NaCl 0.05M và 1 lỗ chứa 40ml NaCl 1M, thông với nhau và có ống dẫn ra ngoài. Cho dịch muối chảy từ từ vào cột gel. Thu liên tục dịch chảy ra từng phân đoạn vào 80 ống nghiệm nhỏ mỗi ống thu 1ml. Tiến hành đo OD280 các ống thu được, đo các ống chẵn theo thứ tự: 2,4,6.80 Kết quả Dịch chiết thô sau lọc có thể tích V = 33ml, OD280 = 1.321 Ta có: OD280 = 0.66 ó 1mg protein/1ml dịch mẫu Protein tổng số thu được là: = 660.5 (mg) Độ tải của gel là 10mg protein/1ml mẫu. Vậy 10ml gel tải được 100mg proteinàGel thừa tải Sơ đồ OD280 của 40 ống chiết mẫu Trên sơ đồ đỉnh cao nhất là đỉnh số 11 hay là OD280 của ống số 22 và có giá trị OD280 = 3.59 Ta có khối lượng protein chế phẩm thu được là: = 5.44 (mg) Ta có bảng số liệu sau: Nguyên liệu Thể tích (ml) Protein (mg/ml) Protein tổng số (mg) Dịch chiết thô 33 20.02 660.5 Chế phẩm 1 5.44 5.44