Báo cáo thực tập: “Kỹ mới trong công nghệ Sinh học”

ứa Ethidium bromide sẽ tạo nên các vòng sang có cường độ sang khác nhau. Trên cơ sở xây dựng một dãy nồng độ ADN chuẩn và chấm lên đĩa thạch, đối chiếu với AND mẫu, chúng ta có thể phát hiện được DNA ở giới hạn rất thấp (<µg). Kết quả so sánh về đường kính và cường độ vòng sang thậm chí còn cho phép bán định lượng DNA trong mẫu nghiên cứu. Đây là phương pháp rất đơn giản cho phép nhanh chóng phát hiện sự có mặt DNA với lượng mẫu rất ít (1µg). Điều rất có ý nghĩa khi lượng mẫu và hàm lượng DNA có được không đủ để định lượng bằng các phương pháp thong thường. 2 Nội dung 2.1 Hóa chất và dụng cụ Các đĩa thạch hay agarose 1,7% có chứa 50µg/ml Ethidium bromide đã được chuẩn bị từ trước và đã được ủ ở 37ºC dạng lật úp ít nhất 10h. Dung dich DNA gốc 2µg/ml. Dung dịch DNA cần định lượng. Đệm TE (Tris-HCl 10mM, pH 8,0 có chứa EDTA 1mM). Ống eppendorf 1,5µl . Pipetman loại 20µl. Máy soi UV. Bút đánh dấu. Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học” Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 2 2.2 Phương pháp tiến hành  Bước 1: Chuẩn bị dãy 8 ống của DNA chuẩn có nồng độ chênh lệch nhau 2 lần: Đầu tiên cho vào mỗi ống 5µl đệm TE. Ống 8 cho thêm vào 5µl DNA chuẩn nồng độ 2µg/µl rồi trộn đều. Hút 5µl từ ống 8 cho vào ống 7 trộn đềulàm tương tự đến ống 2. Ông 1 để nguyên. 8 7 6 5 4 3 2 1 8 7 6 5 4 3 2 1 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học” Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 3  Bước 2: Chuẩn bị 8 ống (được đánh dấu từ 916) chứa mẫu DNA cần xác địch làm tương tự như trên. Chỉ khác là ống số 9 chứa mẫu có nồng độ gốc. 16 15 14 13 12 11 10 9 16 15 14 13 12 11 10 9 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl 5µl Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học” Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 4  Bước 3: Lấy 3µl trong mỗi ống nhỏ lần lượt vào 16 ô trên đĩa thạch đã chuẩn bị sẵn. 3µl  Bước 4: Cho đĩa peptri vào tủ ủ ở 37ºC Bước 5: Lấy đĩa thạch cho vào máy soi UV  Bước 6: So màu bằng mắt thường và xác định kết quả. Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học” Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 5 3 Kết quả Ta thấy ô số 8 với ô 16 và ô số 7 với ô 15 có màu tương đồng. Tức là ta có nồng độ của mẫu bằng nồng độ của DNA chuẩn. Hay nồng độ của mẫu cần xác định xấp xỉ 2µg/µl. Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học” Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 6 Bài thực tập 2: Kỹ thuật các đoạn DNA được nhân bản đồng thời (Multiplex PCR) 1 Gới thiệu 1.1 Kỹ thuật PCR  Kỹ thuật cho phép nhân bản các đoạn DNA hay đoạn gen lên nhiều triệu lần thông qua hàng loạt chu kỳ phản ứng tổng hợp của DNA polymerase. Kỹ thuật PCR yêu cầu phải biết được thong tin về trình tự nucleotit ở hai đầu đoạn DNA cần nhân bản để thiết keesneen cặp primer đặc hiệu.  Các giai đoạn chính của phản ứng PCR: Giai đoạn biến tính của DNA sợi kép: giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ >90ºC, thường dung là 94-95ºC với thời gian từ vài chục giây đến 1 phút. Ở nhiệt độ này DNA sợi kép bị tách thành 2 sợi đơn. Giai đoạn gắn primer: giai đoạn này thường được thực hiện ở nhiệt độ từ 50-65ºC phụ thuộc vào nhietj đọ tách DNA sợi kép thành dạng sợi đơn (Tm) của primer. Trong bước này xẩy ra sự bắt cặp của primer với các đoạn trình tự bổ sung trên DNA. Thời gian cho giai đoạn này thường chỉ cần từ 30 giây đến 1 phút. Giai đoạn kéo dài chuỗi: giai đoạn này được thực hiện ở 70-72ºC là nhiệt độ tối thích hợp của Taq DNA polymerase. Primer được kéo dài theo chiều 5’-3’ bởi Taq polymerase với sự có mặt của dNTPs dưới các điều kiện phản ứng thích hợp. Kết quả là tổng hợp được các đoạn DNA mới bổ sung với một phần trình tự của DNA khuôn. Giai đoạn này thường khoảng từ 30 giây (cho các đoạn DNA cần nhân bản có kích thước dưới 1kb) đến vài phút (cho các đoạn lớn hơn).  Ba giai đoạn biến tính, gắn primer và kéo dài chuỗi được gọi là chu kỳ của PCR. Sau mỗi chu kỳ có số bản sao của đoạn DNA cần nhân bản tăng gấp đôi ban đầu. PCR thường được thự hiện với 25-30 chu kỳ, vì vậy từ một lượng DNA rất nhỏ ban đầu, sau phản ứng ta có thể thu được một lượng bản sao lớn hơn gấp nhiều triệu lần so với ban đầu. Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học” Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 7 1.2 Kỹ thuật multiplex PCR  Kỹ thuật này không khác nhiều so với kỹ thuật PCR thong thường. Điểm khác biệt duy nhất là thay vì sử dụng 1 cặp mồi để nhân lên 1 loại DNA hay gen đích ở PCR thong thường, multiplex PCR sử dụng từ 3 cặp mồi trở lên để nhân lên ít nhất là 2 loại DNA hay gen đích tại cùng một thời điểm và cùng một chế độ nhiệt của chu kỳ phản ứng PCR. Các đoạn DNA, gen được nhân lên đồng thời thường nhằm mục đích phát hiện cùng một lúc nhiều đối tượng (loài,chủng) khác nhau hoặc sang lọc các đối tượng gây bệnh có khả năng đồng nhiễm ở một loại mẫu bệnh phẩm (máu, nước tiểu, mô). Vì thế, multiplex giúp giảm thiểu các thao tác và tiết kiệm thời gian trong chẩn đoán, sang lọc phát hiện bệnh.  Các mồi trong multiplex PCR cần phải được tiết kế sao cho Tm xấp xỉ nhau để có thể gắn bổ sung vào các gen đích tại cùng một nhiệt độ gắn mồi của chu kỳ phản ứng PCR. Các mồi trong multiplex PCR cũng cần được thiết kế để tránh hiện tượng tự bắt cặp bổ sung lẫn nhau hay bắt cặp không đặc hiệu vào gen đích của mồi kia tới ức chế phản ứng kéo dài chuỗi của gen kia.  Hiện nay ký thuật multiplex PCR đã được áp dụng đẻ phát hiện các virus đồng nhiễm lây truyền qua đường máu như HIV, HPV, và HCV, các loại ký sinh trùng gây bệnh sốt rét, các loại các vi khuẩn và nám men gây bệnh phụ khoa, các vi khuẩn gây đường ruột ngộ độc thực phẩm  Trong thí nghiệm này chúng ta sử dụng primer được thiết kế và kỹ thuật mutiplext PCR để phát hiện đồng thời hai loài ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax với kích thước băng DNA được nhân bản tương ứng là 205bp và 121bp. Quy trình thí nghiệm này là một phần kết quả của đề tài KC.10.08/06-10. Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học” Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 8 2 Nội dung 2.1 Hóa chất Taq DNA polymerase (1 đơn vị/µ). Đệm cho Taq DNA polymerase đươch cung cấp nồng độ gấp 10 lần nồng hoạt động (10xTaq buffer). dNTPs ở nồng độ 25mM cho mỗi loại dNTP (2mM). Primers (trong thí nghiệm này là Falci Fw, Falci Rv, Vivax Fw, Vivax Rv (10pmol/µl). DNA khuôn ở nồng độ 5-7ng/µl. Trong thí nghiệm này dung 4 loại DNA khác nhau đó là DNA của Plasmodium falciparum, DNA của Plasmodium vivax, DNA từ mẫu máu nghi nhiễm ký sinh trùng số 1 (M1), và số 2 (M2). dH2O khử trùng. Đệm TE. 2.2 Dụng cụ và máy móc Pipetman (1000, 100, 20µl), đầu côn vàng, đầu con xanh, ống eppendorf 0.5ml, giá để ống eppendorf, máy PCR, mấy điện di ngang, bộ nguồn điện di và máy soi UV (UV transilluminator). 2.3 Phương pháp tiến hành  Chuẩn bị hỗn hợp của các thành phần chung nhau cho 5 phản ứng (Master mix). Trong đó các mẫu khác nhau sẽ khác nhau về DNA khuôn và primer, ngoài ra còn có 1 mẫu kiểm tra không có DNA khuôn. Thể tích cuối cùng của mỗi phản ứng là 1.5ng/µl, dNTPs là 0.2mM, DNA khuôn là 0.5-0.7ng/µl.  Bước 1: Chuẩn bị một ống eppendorf cho vào đó (tạo Master mix): Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học” Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 9 Master mix 110µl 62.5 µl dH2O 12.5 µl đệm Taq buffer (10x) 12.5 µl dNTP (2mM) 5µl Falci Fw (10pmol/µl) 5µl Falci Rv (10pmol/µl) 5µl Vivax Fw (10pmol/µl) 5µl Vivax Rv (10pmol/µl) 2.5µl Taq pol (1pmol/µl) (Cho Taq pol vào sau cùng) Bước 2: Chia đều hỗn hợp cho 4 ống eppendorf, mỗi ống 22µl. 110µl 1 2 3 4 22µl 22µl 22µl 22µl Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học” Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 10  Bước 4: Dùng pipetman cho thêm: 3µl TE vào ống 1 (đối chứng âm). 3µl DNA của P.falciparum và DNA của P.vivax vào ống số 2 (đối chứng dương). 3µl DNA mẫu 1 vào ống số 3. 3µl DNA của mẫu 2 vào ống số 4. 3µl TE 3µl P.fa+P.vi 3µl M1 3µl M2 1 2 3 4 25µl 25µl 25µl 25µl (--) (+) M1 M2 Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học” Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 11  Bước 5: Chạy RAPD-PCR Tiến hành đặt RAPD-PCR với chế độ như sau: Bước biến tính ở 94ºC trong 3 phút(không lặp lại). Bước biến tính ở 94ºC trong 35 giây. Bước gắn mồi ở 60ºC trong 15 giây. Bước kéo dài chuỗi ở 72ºC trong 20 giây. Đặt số chu kỳ lặp lại của 3 bước sau là 29 chu kỳ. Đặt giữ mẫu ở 4ºC sau khi hoàn thành 29 chu kỳ.  Bước 6: Tiến hành điện di với 5 giếng theo các bước: Đổ dung dịch đệm TAE vào bình điện di Cho bản gel (agarose 2%) vào. Hút dung dịch màu (loting die) nhỏ thành 5 giọt trên paraffin. Hút dịch từ 4 ống vừa PCR và 1 ống marker chuẩn bị trước nhỏ vào 5 giọt trên parafin trộn đều rồi nhỏ vào 5 giếng điện di. Chạy điện di với thiết đặt 100V trong 15 phút. Bước 7: Quan sát kết quả trên gel. Báo cáo thực tập: “Kỹ Mới Trong Công Nghệ Sinh Học” Hanoi University of Science, VNU/Biology/Biotechnology/Trần Tuấn Anh Page 12 3 Kết quả 1 2 3 4 Kết quả chụp điện di cho thấy tại vạch số 1 (đối chứng âm) không có vạch nào. Tại vạch số 2 (đối chứng dương) có hai vạch trùng với vạch 100 và 200 trên băng marker vạch số 5. Tại vạch số 3 (mẫu 1) có một băng trùng với băng 100 (kích thước 121bp). Tại vạch số 4 (mẫu 2) có một băng trùng với băng 200(kích thước 205bp). Vậy có thể kết luận mẫu số 1 nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium vivax, mẫu số 2 nhiễm Plasmodium falciparum.